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一

制定背景

近年來，我國進(jìn)口種豬的數(shù)量激增，國外優(yōu)質(zhì)種豬資源大量進(jìn)入我國，在豐富我國本土種質(zhì)資源的同時(shí)也給口岸疫情防控帶來巨大挑戰(zhàn)。

(資料圖片僅供參考)

豬衣原體病是由于感染豬衣原體而引起病豬呼吸道、消化道和泌尿生殖道等多系統(tǒng)感染的動(dòng)物傳染病。由于臨床表現(xiàn)較為溫和，特征性病理變化缺乏，且多伴發(fā)于豬圓環(huán)病毒感染、豬繁殖與呼吸綜合征等其他動(dòng)物疫病，因而長期以來并不受到養(yǎng)殖者的重視。

1955年，Willingan等從患有豬關(guān)節(jié)炎和心包炎的美國家豬中首次分離到豬衣原體。1969年，歐洲首次從罹患多關(guān)節(jié)炎、多漿膜炎、肺炎、結(jié)膜炎、腸炎的流產(chǎn)母豬體內(nèi)分離到豬衣原體。

目前，世界范圍內(nèi)的大部分豬群都存在豬衣原體的感染。隨著研究的深入，豬衣原體感染引發(fā)的鼻炎、結(jié)膜炎、肺炎、腸炎、母豬流產(chǎn)、弱仔和公豬精囊炎等，對(duì)于集約化養(yǎng)殖場以及種豬群體的危害逐漸獲得重視。

不同年齡段的家豬豬衣原體感染狀況

（數(shù)據(jù)來源：https://doi.org/10.1186/s12917-017-1295-x）

豬衣原體主要危害患豬的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)。病原菌可以通過吸入攜帶病菌的分泌物氣溶膠或經(jīng)口攝入消化道進(jìn)行傳播，來自于疫區(qū)的活動(dòng)物和遺傳物質(zhì)的傳入風(fēng)險(xiǎn)較高。為此，研究團(tuán)隊(duì)從監(jiān)測和防控的實(shí)際需要出發(fā)，研制了《豬衣原體檢疫技術(shù)規(guī)范》并提交行業(yè)委員會(huì)審議通過。

2022年7月7日，海關(guān)總署公告2022年第57號(hào)（關(guān)于發(fā)布《進(jìn)境種用雛禽指定隔離檢疫場建設(shè)規(guī)范》等90項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的公告），《豬衣原體病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 5488-2022，以下簡稱《規(guī)范》）發(fā)布，并將于2023年2月1日實(shí)施。《規(guī)范》系豬衣原體病的首個(gè)海關(guān)行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)。

二

主要內(nèi)容

標(biāo)準(zhǔn)的分離培養(yǎng)方法參照了《OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》（2019版，第3.8.5章 1.2和1.3的技術(shù)內(nèi)容）；直接染色方法參照了《OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》（2019版，第3.8.5章 1.1的技術(shù)內(nèi)容）；標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法為重慶海關(guān)技術(shù)中心科研輸出。

《規(guī)范》規(guī)定了豬衣原體病的臨床和病理學(xué)診斷、病原分離和鑒定（含細(xì)胞分離、雞胚分離、染色觀察）、套式PCR和Real-time PCR的技術(shù)要求，適用豬衣原體病的監(jiān)測和檢疫。

（一）縮略語

對(duì)文本中用到的5個(gè)英文縮略語進(jìn)行了解釋，輔助使用者理解標(biāo)準(zhǔn)文本。

（1）FITC：異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate）

（2）SPF：無特定病原（Specific-pathogen-free）

（3）DMEM：杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）

（4）FAM: 藍(lán)色羧基熒光素（Carboxy-fluorescein）

（5）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction）

（二）臨床診斷

該節(jié)描述了動(dòng)物在感染豬衣原體后可能出現(xiàn)的臨床癥狀和病理變化。但由于豬衣原體病的感染通常呈隱性感染，臨床癥狀和病理變化不顯著。對(duì)于該病的診斷需要結(jié)合后續(xù)的病原分離等實(shí)驗(yàn)室檢測方法。

（三）樣品采集

該節(jié)規(guī)定了用于豬衣原體病的樣品的采集要求，具體包括拭子樣品、組織樣品和豬精液的采集方法以及生物安全的要求。采集的樣品可以用于后續(xù)的病原分離、PCR鑒定。

（四）病原分離和鑒定

該節(jié)規(guī)定了豬衣原體在敏感細(xì)胞（Hella 229細(xì)胞或McCoy細(xì)胞）和SPF雞胚上的分離培養(yǎng)方法。若樣品中存在衣原體，經(jīng)過細(xì)胞或雞胚的傳代培養(yǎng)后，將會(huì)獲得增殖。制作的組織觸片、組織切片、細(xì)胞爬片或其他細(xì)胞單層培養(yǎng)物可以通過姬姆薩染色或熒光抗體染色的方法對(duì)培養(yǎng)物中的衣原體進(jìn)行初步鑒定。

豬衣原體陽性標(biāo)本片在鏡下可見胞漿內(nèi)疏松排列的包涵體，包涵體內(nèi)可見許多染成深藍(lán)色或暗紫色的衣原體顆粒；衣原體包涵體顆粒在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)點(diǎn)狀或片狀黃綠色熒光。

圖1. 感染豬衣原體前后的Hella細(xì)胞

（姬姆薩染色）

（五）PCR鑒定

該節(jié)規(guī)定了豬衣原體的聚合酶鏈?zhǔn)綑z測方法。整節(jié)包括兩部分，第一部分為常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)綑z測的體系配制、質(zhì)量控制以及結(jié)果判定；第二部分為實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)綑z測的體系配制、質(zhì)量控制以及結(jié)果判定。

在質(zhì)控成立的前提下，樣品若檢出530bp的擴(kuò)增條帶或特征的熒光擴(kuò)增曲線的，判為豬衣原體核酸陽性。陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行基因序列的測定。

圖2. 豬衣原體ompA基因參考序列

（六）綜合判定

該節(jié)規(guī)定了樣品中是否存在豬衣原體的結(jié)果判定綜合條件。由于豬衣原體感染的復(fù)雜性，結(jié)果的判定不能僅限于一個(gè)檢測試驗(yàn)的結(jié)果，需要綜合多方面進(jìn)行判斷。當(dāng)臨床上出現(xiàn)典型的癥狀或病理變化，且病原分離鑒定或PCR檢測為陽性，可判定為豬衣原體病陽性；當(dāng)臨床上無典型的癥狀或病理變化，且病原分離鑒定或PCR檢測為陽性，可判定為豬衣原體無癥狀感染；不論有無臨床表現(xiàn)，病原分離鑒定和PCR檢測均為陰性，判定為豬衣原體病陰性；動(dòng)物產(chǎn)品中病原分離鑒定或PCR檢測陽性的判為“檢出豬衣原體”，否則判為“未檢出豬衣原體”。

三

應(yīng)用前景

該標(biāo)準(zhǔn)將應(yīng)用于進(jìn)口種豬以及各種豬源性動(dòng)物產(chǎn)品的豬衣原體檢測，是保障優(yōu)質(zhì)種豬資源進(jìn)口、嚴(yán)防豬衣原體病傳入的重要技術(shù)手段；也適用于養(yǎng)豬企業(yè)進(jìn)行豬衣原體病的監(jiān)測和防控，對(duì)集約化養(yǎng)殖場以及種豬群體降低感染風(fēng)險(xiǎn)具有重大意義。