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癌癥為細(xì)胞惡性增生所致，有侵襲性，可轉(zhuǎn)移。手術(shù)切除、放療和化療相結(jié)合是治療癌癥的基本手段。然而，這幾種治療方式都存在許多的局限性，比如達(dá)不到手術(shù)切除的條件、放射治療和化療藥物無法選擇性靶向人體患病細(xì)胞等。因此，合成特定的藥物，使其選擇性地靶向患病細(xì)胞成為眾多醫(yī)藥企業(yè)的努力的方向。2018年羅氏公司公布了一項專利，他們發(fā)現(xiàn)3 羰基氨基 8 氨基異喹啉化合物可以作為HPK1的抑制劑，與其它藥物組合后可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答和治療HPK1依賴性病癥（諸如癌癥）。通過對大量3 羰基氨基 8 氨基異喹啉化合物的篩選，他們發(fā)現(xiàn)GNE-6893可以用于改善T細(xì)胞受體的信號傳導(dǎo)以及增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而提高抗腫瘤免疫力。

(資料圖)

專利報道的GNE-6893第一代合成路線（見圖1）主要包括7步（未將6和7的合成計入），總收率為2.07%，收率較低，不適合作為公斤級原料藥的生成路線。作者認(rèn)為該路線主要存在兩個問題：

其一，實驗手性呋喃醇3的合成。

其二，高度官能團(tuán)化的異喹啉化合物的后期修飾。

圖1：GNE-6893的第一代合成路線

帶著這樣的想法，作者對GNE-6893進(jìn)行了逆合成分析，主要包括氨基甲酸酯的形成、Buchwald-Hartwig 酰胺化反應(yīng)構(gòu)建C(sp2)-N鍵、手性呋喃醇的制備以及Suzuki-Miyaura反應(yīng)構(gòu)建C(sp2)-C(sp2)鍵。帶著這樣的想法，作者對第一代合成路線進(jìn)行了優(yōu)化，以用于實驗公斤級原料藥的合成。

圖 2：GNE-6893的逆合成分析

PART.1

優(yōu)化手性呋喃醇合成

環(huán)氧化合物和甲基氯化鎂反應(yīng)可得到反式-4-甲基-3-呋喃醇(3a)，隨后經(jīng)酯化反應(yīng)可得到3b（圖3）。篩選277個酶后，作者發(fā)現(xiàn)EL012可以實現(xiàn)消旋化合物3b的拆分，并可以99.2%的ee值和34%的分離收率得到(3S,4R)-4-甲基-3-呋喃醇(3)。相比于第一代路線，優(yōu)化后的公斤級路線僅需對小分子化合物3b進(jìn)行拆分，而無需對1b脫保護(hù)后、分子量較大的化合物進(jìn)行拆分，優(yōu)化后的路線對含異喹啉骨架的母核利用率較高，這也是匯聚式合成路線的優(yōu)勢之一。

圖3：(3S,4R)-4-甲基-3-呋喃醇(3)的合成

PART.2

優(yōu)化C(sp2)-C(sp2)鍵的構(gòu)建

通過對鈀催化劑和配體的大量篩選，作者發(fā)現(xiàn)在Pd(OAc)2/(t-Bu)2PMe·HBF4的催化條件下，可以72%的分離收率得到6a，并將價格昂貴的鈀催化劑的當(dāng)量從0.2降到了0.03。僅在0.01當(dāng)量Pd(dppf)Cl存在下，以Cs2CO3為堿，6a和7可通過Suzuki-Miyaura反應(yīng)得到化合物5a。由于回收率低，6a的結(jié)晶工藝無法被開發(fā)出來。為了規(guī)避6a的重結(jié)晶，作者將硼化反應(yīng)和Suzuki-Miyaura反應(yīng)進(jìn)行了連投，然而僅有49.3%的HPLC收率（圖4，Condition A）。反應(yīng)之所以收率低，是因為6a在Condition A中的第二步反應(yīng)中會發(fā)生分解。鑒于，芳基鹵化物的鋰化-硼化和后續(xù)的Suzuki Miyaura反應(yīng)的連投已有相關(guān)報道。作者對此進(jìn)行了嘗試（圖4，Condition B），并可以兩步85%的收率得到產(chǎn)物5a。

圖4：C(sp2)-C(sp2)鍵的構(gòu)建

PART.3

優(yōu)化氨基保護(hù)

在第一代路線中，需加入分子篩除水以實驗5a的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。在本文中，作者采用共沸蒸餾代替分子篩實現(xiàn)了5a的完全轉(zhuǎn)化，并將分離收率從72%提高至89%。相比于第一代路線，操作更為簡單實用。

圖5：氨基的保護(hù)

PART.4

優(yōu)化Buchwald-Hartwig 酰胺化反應(yīng)

通過對堿(K2CO3, K3PO4, KOAc, tBuONa)、溶劑(1,4-dioxane, toluene, t-amyl alcohol)以及催化劑(N-XantPhos Pd G3, Pd(OAc)2/DPEPhos, XantPhos Pd G3, t-BuBrettPhos Pd G3, BuBrettPhos Pd G3, RuPhos Pd G3, XPhos Pd G3, PCy3 Pd G3)的全組合篩選，由于1,4-dioxane具有致癌性，最終作者選定BrettPhos Pd G3/K2CO3/toluene的組合為最佳反應(yīng)條件（圖6）。在此基礎(chǔ)上，作者通過控制變量法，對催化劑的用量、BocNH2的當(dāng)量以及溫度進(jìn)行了優(yōu)化（圖7），并確定了反應(yīng)的最佳條件。在該反應(yīng)中，作者發(fā)現(xiàn)通過甲苯共沸蒸餾后的BocNH2具有更佳的反應(yīng)效果（圖7, entry 5 和 entry 7）。

圖6：胺化反應(yīng)-鈀催化劑和堿的優(yōu)化

圖7：胺化反應(yīng)-溫度、催化劑和胺當(dāng)量的優(yōu)化

PART.5

優(yōu)化2a的脫保護(hù)基步驟

在第一代路線中，水合肼被用來實現(xiàn)2a的脫保護(hù)?？紤]到在放大過程中水合肼有較大的安全隱患，容易發(fā)生爆炸事故，作者用甲胺代替水合肼，并可以兩步75%的分離收率成功得到化合物2。

圖8：氨基保護(hù)基的脫除

PART.6

優(yōu)化氨基甲酸酯1b合成

在第一代路線中，三光氣被用來實現(xiàn)1b的合成?？紤]到三光氣具有非常強(qiáng)的毒性，在放大生產(chǎn)中存在安全隱患，作者將氨基甲酸酯的合成拆分成兩步，即先生成活性較高的氨基甲酸酯1a，再與手性呋喃醇3發(fā)生酯交換實現(xiàn)1b的合成。首先，在第一步中，作者對偶聯(lián)試劑進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)試劑為N,N"-二琥珀酰亞胺基碳酸酯（DSC）時，2的轉(zhuǎn)化率和1a的HPLC收率最高（圖9）；隨后，在保持偶聯(lián)試劑為DSC的基礎(chǔ)上，作者對第二步的酯交換反應(yīng)中涉及的堿、溫度、添加劑以及手性呋喃醇的當(dāng)量進(jìn)行了考察（圖10）。當(dāng)保持溫度為0 oC，在加入分子篩的情況下，對不同的堿進(jìn)行考察時，發(fā)現(xiàn)無論是在step 1 還是在step 2中， DABCO為堿時，1a和1b的收率均優(yōu)于DMAP, NMI和NMM，且副產(chǎn)物2-urea較少（圖10, entry 1-8）?？紤]到后續(xù)的放大，作者將分子篩控除，并升溫至25 oC，對比了DABCO和NMI對反應(yīng)的影響。在step 1中，以NMI為堿時效果優(yōu)于DABCO，但是在step 2中，以DABCO為堿效果優(yōu)于NMI（圖10, entry 9-10）。當(dāng)以NMI為堿時，在step 2升溫至40 oC時，1b的收率可以得到明顯的提高（圖10, entry 11）。在圖10, entry 11的條件下進(jìn)行放大，經(jīng)檸檬酸水溶液洗滌，環(huán)戊基甲基醚（CPME）重結(jié)晶，可以62%的分離收率得到1b。

圖9：合成1a的偶聯(lián)試劑的篩選

圖10：氨基甲酸酯1b的合成優(yōu)化

PART.7

優(yōu)化1b中兩個Boc保護(hù)基的脫除

在第一代路線中，TFA/DCM被用來實現(xiàn)Boc保護(hù)基的脫除。不幸的是，GNE-6893中氨基甲酸酯部分在TFA/DCM的條件下會繼續(xù)發(fā)生降解，得到相應(yīng)的胺，從而導(dǎo)致反應(yīng)收率較低（34%）。通過對比鹽酸和硫酸的條件，以乙腈和水作為混合溶劑，作者很快確定了反應(yīng)的最佳條件，并最終以94%的分離收率得到了最終的產(chǎn)物GNE-6893。

圖11：氨基甲酸酯1b的脫保護(hù)

7步總收率為33%，相較于第一代路線(總收率2.07%)，總收率提高了15倍；

采用了匯聚式路線，將手性呋喃醇3和含異喹啉骨架的化合物2進(jìn)行了分別的合成，提高了2的利用率；

采用酶催化對反式呋喃醇進(jìn)行拆分得到了光學(xué)純的呋喃醇3；

避免了使用危險試劑，以甲胺和DSC分別代替水合肼和三光氣，工藝更為安全，更加符合綠色化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)；

GNE-6893的合成中涉及到了多步鈀催化的反應(yīng)，作者將催化劑的當(dāng)量降低到了3-5 mol%，大大節(jié)約了成本，且鈀催化的反應(yīng)均在路線的前幾步，設(shè)計合理，大大減少了后續(xù)API中金屬殘留問題；

在公斤級路線中，多次實現(xiàn)了一鍋法，如step 1和step 2、step 4和step 5的連投，大大簡化了實驗操作。

圖12：GNE-6893公斤級生產(chǎn)路線

參 考 文 獻(xiàn)

【1】Liang, J.; Mendonca, R.; Siu, M.; Tellis, J. C.; Wang, W.; Wei, B.; Chan, B.; Choo, E. F.; Drobnick, J. A.; Gazzard, L. J.; Heffron, T. 8-Aminoisoquinoline Compounds and Uses Thereof. WO 2020/ 072695 A1, April 09, 2020.

【2】Stumpf, A. Xu, D. Ranjan, R. Angelaud, R. Gosselin, Francis. A Convergent Synthesis of HPK1 Inhibitor GNE-6893 via Palladium-Catalyzed Functionalization of a Tetrasubstituted Isoquinoline. Org. Process Res. Dev. DOI: org/10.1021/acs.oprd.2c00384.